研究网柄菌的个体发育过程

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 土壤样品(S5220)

由刘朴于2016年10月采自云南省苍山清碧溪阔叶林。

1.1.2 培养基

干草琼脂培养基：称取50g干草，加入1000ml蒸馏水中，煮沸40-60min，过滤，向滤液中加入15-20g琼脂粉，定容至1000ml，0.1MPa高压灭菌30min。在超净工作台中倒平板备用。

水琼脂培养基：称量15-20g琼脂粉，加入到蒸馏水中，充分溶解后定容至1000mL，0.1MPa高压灭菌30min。在超净工作台中倒平板备用。

LB液体(固体)培养基：称取LB粉末20g，加入蒸馏水中，加热煮沸使之充分溶解，定容至1000mL，0.1MPa高压灭菌15min。在超净工作台中倒平板备用。

1.1.3 主要试剂和仪器

NuClean Plant Genomic DNA Kit新型植物基因组DNA提取试剂盒，康维世纪生物科技有限公司。

电子分析天平，诸暨市超泽衡器设备有限公司；高压灭菌锅，微(厦门)仪器有限公司；超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；摇床，江苏省金坛市医疗仪器厂；实验室纯水系统，上海和泰仪器有限公司；光照培养箱，上海新苗医疗器械制造有限公司；恒温振荡培养箱，上海智城分析仪器制造有限公司；实体解剖镜，蔡司公司；光学显微镜，Leica公司；PCR仪，Eppendorf公司。

1.2 方法

1.2.1 制备大肠杆菌Escherichia coli悬液

挑取大肠杆菌单菌落接至LB液体培养基中，37℃、200r/min振荡培养约24h。

1.2.2 制备土壤悬液

将土壤样品和蒸馏水以1:10的比例混合，25 ℃、180-200 r/min振荡培养1h后再静置1h。

1.2.3 分离

无菌条件下在干草琼脂培养基平板上加入0.5mL大肠杆菌悬液，再加入0.5mL土壤基物悬液。每个样本重复5次。17℃恒温培养，每天观察培养皿中是否有网柄菌长出、发育情况，以及是否有杂菌菌落生成。

1.2.4 纯化

无菌条件下在水琼脂培养基平板上加入0.5mL大肠杆菌悬液，再将分离得到的网柄菌孢子转接至水琼脂培养基上，于17℃恒温培养箱中培养。

1.2.5 鉴定

将纯化的菌株在实体解剖镜和光学显微镜下观察并记录孢子、黏变形体、集群、孢堆果柄、孢子团的特征，以及有无大孢囊和小孢囊。

1.2.6 生活史观察

(1) 孢子萌发及黏变形体的观察：先向双凹载玻片中加入适量无菌水，然后挑取纯化的大头网柄菌D. macrocephalum孢子团加入无菌水中，盖上盖玻片，用凡士林封口，将双凹载玻片放入17℃恒温培养箱中培养。培养8h后于光学显微镜下观察孢子的萌发情况，并及时做好拍摄记录工作。

(2) 宏观形态发育的观察：观察到孢子萌发并释放黏变形体的过程后，向水琼脂培养基平板上添加0.5mL大肠杆菌，接入大头网柄菌D. macrocephalum孢子悬液，于17℃恒温培养。10h后开始观察集群、假原质团、假原质团迁移、拔顶、孢堆原最终形成孢堆果等发育过程并记录。