人粘蛋白/粘液素5ACELISA检测试剂盒操作流程

人粘蛋白/粘液素5ACELISA检测试剂盒操作流程：

（1）待测样品孔中每孔加入待测样品100μl，每种样品设3个平行孔；设两个阴性对照孔，每孔加未处理组的细胞裂解液100μl；另设一个空白对照孔，加入纯细胞裂解液100μl。 

（2）酶标板置4℃，包被过夜。

（3）洗板：吸干孔内反应液，用洗涤液过洗一遍（将洗涤液注满板孔后，即甩去），之后将洗涤液注满板孔，浸泡1-2分钟，间歇摇动。甩去孔内液体后在吸水纸上拍干。重复洗涤3-4次。

（4）阴性对照孔每孔加入PBS 50μl，样品孔及空白孔每孔加入1:500稀释的兔抗人AIF抗体工作液50μl。 

（5）酶标板置37℃培养箱的湿盒内，孵育60min。 

（6）洗板，同（4）。 

（7）每孔加1:5000稀释的HRP-标记的山羊抗兔抗体工作液 100μl。 

（8）酶标板置37℃培养箱的湿盒内，孵育60min。 

（9）洗板，同（4）。 

（10）每孔加TMB显色液 100μl，轻轻混匀10s，置37℃暗处反应15-20min。 

（11）每孔加100μl 2mol/L H2SO4终止反应。 

（12）分别测450nm 吸光值W1和630nm吸光值W2，最终测得的OD值为两者之差（W1-W2），以减少由容器上的划痕或指印等造成的光干扰。

（13）数据处理：在得出标本（S）和阴性对照（N）的 OD值后，计算S/N值。S/N≥2.1为阳性判定标准。