乳酸杆菌属通用探针法荧光定量PCR试剂盒常见问题与解决方法

乳酸杆菌属通用探针法荧光定量PCR试剂盒常见问题与解决方法:

阳性对照、待测样本均无条带。
1)、PCR反应体系或反应条件不合适。
2）、PCR试剂保存不当失去活性。
3）、引物设计问题。
解决方法：
1）使用梯度PCR摸索PCR反应条件。
2）2× PCR Mix应保存于-20℃，使用时避免反复冻融。若使用频繁，可在4℃短时间存放。
3）尝试重新设计引物进行检查。

阳性对照有目的条带，待测样本无条带或条带弱。
1、不当储存或长期储存引起试剂活性丧失。
2、加入组织裂解液过量。
3、样本裂解混合液保存不当或保存时间过久，DNA基因组已经降解。
4、模板加入量不适合。
5、PCR循环数不足。
解决方法：
1、使用新鲜的试剂。
2、增大反应体系，或减少裂解液的用量。
3、裂解混合液液可在4℃保存2-3天，尽量使用新制备的裂解液混合液进行PCR。
4、在反应体系10-20%范围内优化模板加入量。反应效性能较差时，可以降模板浓度调节到低于10%的范围。
5、适当增加PCR的循环数，推荐在35-40循环为佳。因为模板复杂，一般PCR反应要比用纯化的 DNA模板多5-10个循环为佳。

非特异性扩增

1、PCR退火温度太低，循环数、引物浓度或模板浓度太高。
2、PCR引物错配。
3、配制PCR反应体系时温度太高或配制完成后放置时间太久。
解决方法：
1、增加PCR退火温度，降低PCR循环数、引物浓度或模板浓度。
2、重新设计PCR引物。
3、PCR反应体系的配制在低温下进行，配制完成后尽快进行PCR扩增反应。

阴性对照出现目的条带

1、操作工具或试剂污染。
2、样本间交叉污染。
解决方法：
1、实验所有试剂或器材均应高压灭菌。操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。
2、每个取样器只对一个样本使用；或取完一个样本后，将取样器刃口浸入2%的次**钠溶液中，反复涮洗，然后用干净的纸巾擦干残液。