PCR的原理类似于DNA的天然复制过程

        PCR技术是一种模拟自然DNA复制过程的体外酶促合成特异性核酸片段技术（亦称无细胞分子克隆技术）。它以待扩增的两条DNA链为模板，由一对人工合成的寡核苷酸作为介导，通过DNA聚合酶促反应，在体外进行特异DNA序列扩增。其过程包括模板变性（denature）、引物退火（annealing）和用DNA聚合酶延伸（clongation）退火引物在内的重复循环系列，使末端被引物5’端限定的特异性片段成指数形式累积。由于在每一循环中合成的引物延伸产物可作为下一循环中的模板，因而每次循环中靶DNA的拷贝数几乎呈几何级数增长。因此20次PCR循环将产生约一百万倍（220）的扩增产物，具有操作简单、快速、灵敏度高、特异性强的特点，并且具有从DNA粗制品和降解的DNA模板中扩增靶序列的能力，这一点在生药鉴定应用中尤为重要。 

在微量离心管中加入适量缓冲液，加微量模板DNA，四种脱氧单核苷酸（dNTP），耐热Taq聚合酶及两个合成DNA引物，并有Mg2 存在。 随后，轻轻旋紧微量离心管的盖子，以避免反应过程中的任何意外泄露。将离心管置于预热的热循环仪中，设定好特定的温度程序，这是PCR（聚合酶链式反应）的关键步骤。初始阶段，高温变性步骤启动，使得模板DNA的双链解旋成单链，为后续的引物结合提供条件。

紧接着，温度迅速下降至适宜引物退火的温度，此时，两个合成DNA引物特异性地结合到模板DNA的单链上，如同锁与钥匙般精确匹配。这一过程确保了PCR的特异性，即只扩增我们感兴趣的DNA片段。

随着温度再次上升至Taq聚合酶发挥作用的最佳温度，酶开始利用其强大的催化能力，以dNTPs（四种脱氧单核苷酸）为原料，沿着引物延伸，合成与模板DNA互补的新链。这一过程在热循环仪内反复进行，每个循环都使DNA的数量翻倍，直至达到实验所需的扩增水平。

期间，Mg2+作为不可或缺的辅因子，不仅稳定了DNA双链结构，还促进了Taq聚合酶的活性，确保了PCR反应的顺利进行。通过调整Mg2+的浓度，研究人员可以进一步优化PCR的效率与特异性。

经过预定数量的循环后，PCR反应结束。此时，微量离心管中已充满了大量扩增的DNA片段，它们将用于后续的分析、克隆或检测等实验。这一简单而强大的技术，不仅极大地推动了分子生物学领域的发展，也让我们对生命的奥秘有了更深入的探索与理解。
​    PCR的原理类似于DNA的天然复制过程，关键是运用两个起始引物，分别为待扩增序列的相对的两条单链DNA结合，结合位点分别位于待扩增序列的两端，并且3’端相对，然后利用DNA聚合酶依赖于DNA模板的特性，模仿体内的复制，在两个引物之间诱发聚合酶反应。PCR反应可以简述如下： 

1、加热使模板DNA在高温下（95℃左右）变性，双链DNA解开而变成单链DNA游离于溶液中。这是所谓变性阶段。 

2、PCR的引物是两段人工合成的寡核苷酸链，长度为16－24个核苷酸残基，其顺序由被扩增的DNA片段两端的序列决定。这两段寡核苷酸链分别与模板DNA的正链和负链互补，所互补的位点一个在被扩增序列的“上游”，一个在被扩增序列的“下游”。高温使模板DNA变性成单链以后，温度降低，由于PCR反应体系中引物的拷贝数远远多于模板DNA的拷贝数，因而引物与模板DNA形成复合物的机率要大大高于模板DNA两条单链的重新结合。只要严格地控制复性的条件，复性过程是倾向于形成引物与模板的复合物的。这是退火阶段。 

3、溶液反应温度升至中温（72℃），在Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条双链在解链和退火之后延伸为两条双链。这是延伸阶段。 

如此重复，改变反应温度，即高温变性，低温退火，中温延伸三个阶段。这三次改变温度为一个循环。每循环一次，使特异区段基因拷贝数扩大一倍，一般30次循环，基因放大数可达2n倍。可用公式 

Y＝（1＋X）n 

表示，式中Y＝DNA扩增倍数，X＝扩增效率，循环数为n。 

如X＝100%，n＝20时，Y＝1048576倍。但实际扩增效率（X）不会达到100%。 

 

2 试验条件 

本程序适用于自动PCR操作，可适用于大多数情况，所用酶是不含核酸外切酶活性的热稳定聚合酶，如Taq聚合酶等。