间接ELISA实验中一抗二抗最佳浓度探究

      在间接 ELISA 实验中，一抗和二抗的 “最佳稀释比例” 没有固定标准，需根据抗体特异性、效价、来源（如单克隆 / 多克隆）、实验目的（定性 / 定量）及样本类型通过预实验确定。以下是基于常规实验场景的参考范围、核心影响因素及优化方法，帮助高效找到适配的稀释比例：

在间接ELISA实验中，一抗和二抗的最佳稀释比例需根据实验条件和目标蛋白特性进行优化，以下是关键要点：

一、一抗稀释比例

常规范围‌

推荐起始稀释比例通常为 ‌1:100至1:1000‌‌，具体需结合抗体说明书建议。
对于高丰度抗原（如血清IgG），可尝试 ‌1:200至1:500‌‌；
低丰度抗原（如细胞因子）建议 ‌1:50至1:100‌‌。

‌优化方法‌

采用棋盘滴定法：通过梯度稀释（如1:50、1:100、1:200等）测试，选择强阳性样本OD值接近0.8、阴性样本OD值<0.1的稀释度‌。
预实验验证：若说明书推荐1:200，建议测试1:50至1:500的系列稀释‌。
二、二抗稀释比例

‌常规范围‌

酶标二抗通常稀释 ‌1:5000至1:10000‌‌，荧光标记二抗为 ‌1:200至1:2000‌‌。
需注意二抗的标记物类型（如HRP、AP）和检测系统灵敏度‌。

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优化要点‌

通过间接法测抗体时，酶标二抗工作浓度可通过绘制A值曲线确定（如1:1600）‌。
避免过度稀释导致信号不足，或稀释不足引发高背景‌。
三、注意事项

样本稀释‌

高浓度样本（如血清）需预稀释（1:100-1:500）以避免钩状效应‌。
梯度稀释法（如先10倍再20倍）可减少误差‌。
‌抗体选择‌

一抗需匹配样本种属（如大鼠样本避免鼠源抗体）‌。

二抗需与一抗宿主种属匹配（如抗兔IgG二抗用于兔源一抗）‌。

（注：视频组件可展示棋盘滴定法的操作流程）

建议通过预实验确定最佳稀释比例，并结合试剂盒标准曲线范围（如OD值1.2附近）调整‌。

四、快速优化 “最佳稀释比例” 的方法（预实验设计）

通过 “棋盘式预实验” 同时验证一抗和二抗的组合稀释比例，高效筛选最优条件，步骤如下：

固定抗原包被浓度：按前期确定的最佳包被浓度（如 5 μg/mL）包被 96 孔板，封闭后备用。

设置一抗稀释梯度：在横排设置 3–4 个梯度（如 1:2000、1:5000、1:8000、1:10000），每孔加 100 μL 稀释后的一抗，室温孵育 1–2 小时，洗板。

设置二抗稀释梯度：在竖排设置 3–4 个梯度（如 1:3000、1:5000、1:8000），每孔加 100 μL 稀释后的二抗，室温孵育 1–2 小时，洗板。

显色与读数：加 TMB 底物显色 15–30 分钟，终止后测 450 nm 吸光度（OD 值）。

筛选标准：选择 “阳性孔 OD 值≥1.0（信号充足）、阴性孔 OD 值≤0.2（背景低）、阳性 / 阴性 OD 比值（P/N）≥5” 的一抗 + 二抗组合，即为最佳稀释比例。