为大家介绍下酶联免疫吸附实验（ELISA）中优化包被的方法

         酶联免疫吸附试验（ELISA）是利用抗原、抗体的特异性免疫反应与酶的催化反应相结合建立起来的一项免疫检测技术。而包被是ELISA实验第一步，也是比较关键的一步。ELISA包被是指将抗原或抗体结合到固相载体表面的过程，也称为固相化。这个载体可以是96孔板，也可能是磁珠或其他材料。接下来，为大家介绍下酶联免疫吸附实验（ELISA）中优化包被的方法。

‌选择合适的包被抗原‌

‌天然蛋白‌：需纯化后使用，避免杂质干扰（如细菌提取物需去除内毒素）‌。
‌重组蛋白‌：高纯度、特异性好，可直接包被‌。
‌小分子抗原‌：需与载体蛋白（如BSA、OVA）偶联后包被，增强吸附能力‌

优化包被缓冲液‌

‌碳酸盐缓冲液‌（pH 9.5）：适用于大多数蛋白，碱性条件增强吸附‌。
‌磷酸盐缓冲液‌（pH 7.2-7.4）：适用于不耐碱的抗原‌。
可添加MgCl₂（30 mmol/L）或CaCl₂（100 mmol/L）增强抗体吸附‌

包被的温度
  常见的包被温度室温（18-25°C）、 4°C(冷藏)和37°C(孵育箱)。室温（18-25°C）适用于大多数抗原和抗体。室温包被操作简便，通常需要过夜包被(12-16小时)，或在摇床上孵育2-4小时； 4°C(冷藏)这种方法可以程度地保持其生物活性，但需要更长的包被时间，通常需要过夜包被(16-24小时)； 37°C(孵育箱)这种方法可以缩短包被时间，但可能会增加一些不稳定的抗原或抗体变性失活的风险。具体可以参考试剂盒说明书或相关文献来了解目标抗原或抗体的最佳包被条件。

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确定最佳包被浓度‌

通过方阵滴定法（棋盘法）筛选，使强阳性样本OD值≈0.8，阴性样本OD<0.1‌。
典型浓度范围：1-10 μg/mL，过高易导致多层吸附，洗涤时脱落‌。
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包被后封闭与保存‌

‌封闭‌：1-5% BSA或5%动物血清，37℃ 1小时，减少非特异性结合‌。

‌保存‌：包被板冷冻干燥后-30℃可存6个月，湿板4℃仅存3天‌。

包被后的封闭选择
  ELISA板的表面会残留一些未被包被抗原/抗体占据的位点，这些位点容易吸附后续步骤中加入的检测抗体、酶标抗体等试剂，造成非特异性结合，导致背景信号增高，影响结果判断。常用的封闭剂有0.05%-0.5%的BSA、10%的小牛血清、1%明胶、5%的脱脂奶粉等。大家可以进行预实验，比较不同封闭液的封闭效果，选择最佳的封闭液。

封闭非特异性结合位点
包被后，必须封闭任何剩余的结合位点，以防止非特异性相互作用。常见的封闭剂包括牛血清白蛋白（BSA）或脱脂奶粉。优化封闭剂的浓度和选择，可以最大限度地降低背景噪音，并提高抗体与包被抗原的特异性结合