ELISA测定中景向测定成败温育最为关键的一个因素

        科研狗每天勤勤恳恳，不怕早起抢仪器，不怕熬夜写报告，最最最最怕的是…做了 N 久的实验，最后却被试剂坑了一把。一首凉凉送给曾经踩过 ELISA 试剂盒坑的各位～
        ELISA 试剂盒厂家琳琅满目，质量良莠不齐。如何浪里淘金，选择既符合研究需求，又品质上乘的 ELISA 试剂盒呢？在 ELISA测定中景向测定成败温育最为关键的一个因素。        
       ELISA作为一种固相免疫测定,抗原抗体的结合反应在固相上进行,要使液相中的抗原或抗体与固相上的特异抗体或结合,必须在一定的温度条件下反应一定的时间。温育所需时间与温度成反比,即温度越高,则所需时间相对较短。最为常用的温育温度有37℃和室温,其次是43℃和2~8温育这一步是临床 ELISA测定中最容易出现问题的步骤。通常目前国内 ELISA商品试剂盒的反应温育时间37℃30分钟~小时,进口 LISAI试剂剤盒则通常为37℃1~2小时才能有较完全的结合,低于1小时,可能会影向测定下限。因此,关于温育,在实际测定操作中一定要注意以下几点：
（1）、要保证在设定的温度下有足够的反应时间。一般来说,加完样本和或反应试剂后,将微孔板从至水浴箱或温箱中时,孔内温度从室温升至37℃,需要一定的时间,尤其是在室温比较低以及非水状态下,这段升温时间可能还比較长,而在临床实验室中,很少有人注意这个问题,通常是将微孔板一放温箱即开始计时,这样就很容易造成实际测定中温育时间不够,弱阳性样本测不出来的问题。曾有一地处南方的血站同行提出了一个问题,就是在每一年的冬季总有那么ー个多月的时间,在做HBsA测定的室内控中,测定由卫生部临床检验中心供应的1ngm弱阳性就与南方冬天室内温度较低有关,此时微孔板转入温箱后37℃温育时间不够,以致弱阳性样本测定为阴性。因此,为保证37℃下足够的温育时间,临床实验室可自行确定本实验室不同季节(不同室温下)微孔板从室温拿至温箱后需要多长时间孔内温度才能达到37℃,从而适当延长板条在温箱中的放置时间。具体的做法是,用一小温度计放置板孔反应溶液中测量观察即可。
2)温育温度的选择。在有的 LISA试剂盒的说明书中,指温育温度可有两种,例如,一种是37℃下1时,另一种则为43℃下45分钟。从免疫测定的抗原抗体反应的本质来看,在较低的温度下反应较长的时最为完全下反应24小时。较高的反应温度,由于分子运动的加怜惜,反应时间缩短,这一点对分子含量较多的强阳性样本的测定浸有问题,但对分子含量少的弱阳性样本则有漏检的可能。因此,我们建议在临床 ELISA测定中尽量使用较低温育温度较长反应时间的条件。
(3)“边缘效应"的排除。以前在使用96孔板的 ELISA测定中,常发现有边缘效应,即外周孔显色较中心孔应的原因可能为96孔板周孔与中心孔表面或热力学特征的不同。但有研究证实在温育中的热力学梯度可能是根本原因之所。聚苹yi烯本身为不良热导体,在实验室的常规 ELISA测定中,将板从室温(通常在25し左右)置于37℃温箱,板也升温时,在外周孔与中心孔之间可能存在一热力学梯度。因使用水浴或在将反应溶液加入至板孔中时,将板和溶液均加热至温育温度(如37℃),就可以很容易地排除边錄效应",并且可提高测定的重复性